稱取0.1g試樣（含蛋白質7.5mg-25mg的樣品），于水解管中，在冰水浴中冷卻 30min後加入2mL已經冷卻的過甲酸溶液，蓋好瓶塞後置于0℃±1℃冰箱中，冰浴16h。向各水解管中加入0.3mL氫溴酸，振搖後冰浴 30min，在60℃±2℃氮吹儀上濃縮至幹。向水解管内加入6moL/L鹽酸10mL，沖入氮氣1min 後，擰緊螺絲蓋，将水解管放在110℃±1℃的恒溫幹燥箱内水解24h後取出冷卻至室溫。将水解液用超純水轉移并定容至25mL容量瓶中，混勻，濾紙過濾。吸取濾液1mL于60℃±2℃氮吹儀上濃縮至幹，殘留物用1mL超純水溶解，待衍生。

用超純水配置磺基丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸标準品溶液1μmoL/mL，待衍生。

分别将月旭科技氨基酸衍生方法包中 A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的 1/5；精密量取混标溶液及樣品溶液各160μL，加入稀釋後的衍生溶液 A、B 各100μL，混勻，室溫反應60min；然後加入正己烷溶液 400μL，旋緊蓋子後振搖10s，室溫靜置分層，取下層液200μL，加入800μL水中，混勻；再移取200μL加入到800μL水中，混勻，用0.45μm 有機濾膜過濾，即得。

色譜柱：月旭Ultimate^® AQ-C18（4.6×250mm，3μm）。

柱溫：40℃；

紫外檢測器：254nm；  

流速：1.0mL/min；  

進樣量：5μL。

1. 磺基丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸标準品溶液1μmoL/mL。

用月旭Ultimate^® AQ-C18（4.6×250mm，3μm）色譜柱，在該色譜條件下測定，能滿足實驗需求。