關于梯度方法轉移的Q&A

01、問：我開發的一個方法在我的系統上重複性非常好，但是在其他系統上就不一樣了，怎麼回事？

答：有時候換色譜系統時梯度方法會出現一些問題。除非系統完全一樣，否則保留時間總有些變化。通常這個時間的變化都在分離度的範圍之内，忽略它，方法還是可以用的。另外，如果适當了解潛在的原因，可以調節梯度在不同的色譜系統中得到相同的效果。

另一個涉及到這個問題的是梯度滞後體積。它是從梯度混合處到柱頭的體積。當你進樣開始分析後，梯度并沒有到達柱頭，還要等滞後體積排空後才到。這就是說樣品在開始一段時間是等度遷移的。由于不同系統的滞後體積是不同的，所以保留時間就不一樣了，有時候還是影響到分離度。

另一個原因是梯度本身，由系統與系統之間的組分差異導緻。對于現在大部分的色譜廠家來說這個問題都不是很嚴重。但通常，在輸送等比例的流動相時（50%A和50%B）精确度更高，比例相差大時（5%A或95%A）精确度就會受損。

02、問：怎麼才能知道我是哪種情況呢？

答：更簡單的做法是比較一下兩個系統的梯度。卸掉柱子，接雙通。（在梯度的B溶液後接紫外檢測器）如果用的是反相色譜，可以在B溶液中加10mg/L的對羟基苯甲酸丙酯。兩個系統都開始運行梯度，記錄基線。然後比較一下兩張圖譜。要找到梯度開始的位置，測量梯度圖譜。如果梯度是線性的，隻要測量梯度的斜率就可以了。

很可能你會發現兩台儀器的梯度開始時間不一樣，圖譜非常類似，梯度結束時間有一定的改變。這種情況就是說兩台儀器的梯度滞後體積不一樣。

03、問：如果是這種情況，有沒有簡單的方法抵消滞後體積的差異呢？

答：有一個辦法大部分時候可以采用。如果新系統的梯度滞後體積小于轉移前系統的體積，可以在梯度開始加一段等度。如果新系統滞後體積大，這種情況就比較困難。原則上你可以先開梯度，延後一段時間進樣，這段時間要與兩台儀器的滞後時間差一緻。但在自動系統中就不能這麼做，自動系統中是進樣觸發梯度開始的，這時候可能需要手動基線歸零或重新開發方法。

04、問：在我花費時間開發方法後碰到這種情況可真不樂見啊，我以後該怎麼做才能避免呢？

答：你可以在更終使用的儀器上開發方法。這可能需要一些預見與計劃，但通常還是可行的。你需要做的是了解新系統的性能，要知道系統的兩個基本情況：梯度滞後體積和比例精确性。你可以在同一個實驗裡得到這兩個數據：如前所述，在B溶液後加紫外檢測器，設置一個多階層的梯度，B溶液以5%的幅度從0%變到1OO%，流速與平常一樣，應該是1mL/min吧。每段梯度大概保持5min。然後接雙通運行梯度，記錄圖譜。每段梯度設置的時間與實際發生的梯度時間之差就是梯度延遲時間。階層的高度可以用來測量流動相比例。這些階層可能有點模糊，那是由系統中混合體積造成的。 

檢測完系統，就可以按照它的性能來設計方法了。正如我前面提到的，更大的問題是梯度滞後體積。如果你知道新儀器的滞後體積比開發方法的儀器大，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差别。如果目标系統滞後體積小，你就要在轉移方法的時候在方法開始加一段梯度延遲時間。

如果比例差别是在梯度運行中間出現的，相信你也可以通過調節梯度圖譜來抵消這種差别。

這個讨論是假設柱子已經用初始流動相充分平衡了。有時我會遇到這樣一些情況，在日常分析中，梯度變化很快，而柱子沒有用初始流動相平衡好。這樣di一針時總是與後面的不一樣。這可能是加快方法的缺點，但是如果轉移到有不一樣滞後體積的系統時，可能就會産生一些問題。