蛋白與配體能否結合、結合的強弱會直接影響蛋白檢測或純化實驗的成敗。此篇文章由月旭科技首席科學家王國斌博士執筆，對蛋白結合和解離常數進行了較為系統的講述。

蛋白和配體結合的強弱不同，對于蛋白檢測以及親和分離純化實驗有顯著影響。在設計實驗時應考慮這種結合強弱影響，以便采用合适的蛋白或配體濃度（包括更低檢測限濃度），估算結合時間，獲得更佳并且實用的結果。 這對于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持更高活性蛋白的純化尤為重要。

常規的蛋白檢測方法，比如ELISA，隻能測定實驗結束時的蛋白結合數值，不能跟蹤整個過程。這不利于獲取結合的動力學數據，阻礙了實驗的優化。自從上個世紀90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術後，目前已有幾種生物傳感器技術，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結合過程，檢測結合的全部過程，給出結合的動力學數據。下圖是我在SRU Biosystems用光學生物傳感測定蛋白A和不同濃度人類IgG随時間變化的結合曲線。IgG濃度在100μg/mL時，結合在2-3分鐘内迅速上升後，緩慢增加。在濃度減小時，結合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時，結合在180分鐘内持續穩定地增加。濃度小于1μg/mL時，結合仍然進行，但是十分緩慢。

圖1. 10種濃度的人類IgG與光生物傳感器表面

的蛋白A結合的real-time時間曲線。

IgG濃度從100μg/mL，做1:2稀釋，

直到0.09μg/mL（90ng/mL）和0對比。

絕大多數生化實驗室，沒有real-time跟蹤檢測手段，蛋白檢測或者純化過程中，确定蛋白的濃度和結合時間通常根據結合的強弱來确定，而結合強弱是通過解離常數來判斷的。

在化學、生物化學中，解離常數（K_D) 是一種反應的平衡常數，用于測量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數是結合常數的倒數。 雖然解離常數是動力學理論的參數， 但是它在生物化學，尤其實驗設計上有現實意義的指導作用。

對于一個可逆的蛋白結合過程

（1）P+L⇌P L

PL是蛋白P和配體L的親和産物。解離常數K_D定義為

（2）K_D=[P]_e[L]_e/[PL]_{_e}=1/K_A

其中[P]_e’[L]_e和[PL]_e分别是到達平衡時，P、L和結合物PL的濃度。K_A是結合常數。結合率ϴ定義為蛋白P與配體L結合成PL的比例。

（3）ϴ=[PL]_{_e}/[P]_t 

[P]_t是起始的蛋白P總濃度。平衡時蛋白濃度

（4）[P]_e= [P]_t-[PL]_e 

等式（2）變成

 (5) K_D=（[P]_t-[PL]_{_e}）[L]e/[PL] 

等式（5）變成

(6) [PL]_{_e}/[P]_t=[L]_e/(K_D+[L]_e)  

結合率ϴ轉化為  

（7） ϴ=[PL]_{_e}/[P]_t=[L]_e/(K_D+[L]_e)

平衡時省餘未結合配體濃度

（8）[L]_e=ϴ K_D/(1-ϴ)                         

當蛋白L有一半結合時，ϴ=0.5

（9） [L]_e=K_D                                     

更後平衡狀态結合配體的濃度就等于解離常數。下面闡述其實用價值。

圖2. 不同配基濃度和蛋白結合率ϴ。

K_D=1nM——；K_D=5nM——

例如K_D為1nM時，更後剩餘的配基平衡濃度為1nM，一半的蛋白會與配體結合（ϴ=0.5）。K_D為5nM時，更後剩餘的配體平衡濃度為5nM時，一半的蛋白會與配體結合（ϴ=0.5）。如果想要提高蛋白結合率到六成（ϴ=0.6圖中紫線），就要增加配基濃度，達到更後配基平衡濃度分别為1.5nM（K_D=1nM）和7.5nM（K_D=5nM）。對于蛋白A填料來說，配體就是抗體，不同動物/總類的抗體有不同的K_D。如果給與足夠時間，結合達到平衡後（靜态載量），沒結合抗體的濃度也不同。K_D小，會有更高的靜态載量，分離得更完全。 要想提高低K_D抗體的載量，隻能提高填料表面蛋白A的密度。如果時間短，沒有達到更後的結合平衡，現實的例子就是抗體流過蛋白A填料柱。在相同時間裡，K_D小的，會有更多的抗體與蛋白A結合。對于同樣的K_D流速低，時間長，動态載量也會更高。

反之， 在更後配體平衡濃度為8nM（圖中紅線）時，K_D小（1nM）的蛋白結合率能達到0.89，而K_D大（5nM）的蛋白結合率隻有0.62。 這對于無蛋白檢測時，試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗（檢測抗體）或者熒光标記的二抗以及鍊黴親和素（Streptavidin）濃度确定後，K_D對蛋白（被檢測物）的濃度測定的影響就顯而易見。K_D小的被檢測蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，結合率高，檢測結果更準确。如果K_D較大，就要提高二抗濃度，以确保檢測數據可信度，或者縮短實驗周期。

圖3. 蛋白結合強弱劃分定義

在分子生物學上，K_D<10^-8M (10nM或者0.01μM)屬于強結合； 10^-4M>K_D>10^-8M屬于中等結合；K_D>10^-4M (0.1mM)屬于弱結合。蛋白A與不同種類抗體結合的強弱不同。例如protein A與人類IgG1、IgG2和IgG4的K_D約為2×10⁻⁹M，屬于強結合。下表列出不同抗體與蛋白A結合的強弱情況。蛋白檢測，分離純化過程中，應該參照結合強弱，設計操作方案。

鍊黴親和素（streptavidin）是生物化學常用的試劑。它于生物素（biotin）結合的K_D非常小，僅為~10⁻¹⁴M。 強度與共價鍵類似。前文介紹過，鍊黴親和素是非常穩定50K_D蛋白，經常用來與熒光、紅外、ELISA标記等化學結合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學結合。這樣帶有标記的鍊黴親和素，與帶有生物素的蛋白結合，從而避免直接标記蛋白。鍊黴親和素和生物素K_D小。對比于直接标記二抗的方法，采用标記的鍊黴親和素-生物素的方法用量小、時間短，達到準确檢測的目的。基于這種原因，标記的鍊黴親和素、化學活化的生物素以及生物素結合的二抗等蛋白檢測試劑，比較容易購買，這對于實驗方案設計非常便利。

作者✦

王國斌，美籍華人博士，在生命科學和表面化學領域有着20多年的産品研發經驗。擁有反相表面聚合技術等多項發明專利，并有GRAFT-COAT™塗層技術和蛋白質的HydroGel™塗層載玻片等多款專利産品面世。曾就職于多家醫療器材和生物科技公司，包括Perkin Elmer和SRU Biosystems，參與開發了 BIND™生物傳感器。

王國斌博士憑借在高分子化學、表面科學、蛋白質兼容表面等方面的豐富經驗，在加入月旭科技後，主持研制了“續淨一号”銀離子消毒液，并對月旭科技的蛋白純化系列産品的研發提供了ji大的技術支持。為今後月旭科技在生命科學領域的發展注入一劑強心針。