不同色譜柱和不同批次之間的重現性

 問：我要開始開發一個新的HPLC方法。驗證之後，該方法将轉道QC實驗室并将使用許多年。我擔心該方法的長期的重複性，特别是柱子的長期重複性。怎樣才能确保好的重複性呢？

答：首先，我要表揚你在開始做這個方法的時候就能考慮到這個方面。如果可以預料到該方法将要使用好幾年，在選擇柱子方面就要做些功課。要想使柱子在該方法的可預見的适用期内使用，就要選擇一些大的生産廠家。另外，要選擇一種标準的表面化學物質（比如C18或C8）而不是那些新奇的或很少使用的。

下一個标準才是柱子的重複性，如果你或你的同事以前用過一根柱子有很好的重複性，這是一個很好的起點，同時也要考慮生産商提供的信息。近來有的廠家開始印刷他們的說明和不同批次的重複性實驗的結果。你可以從廠家得到這些信息然後細心對照。

 問：我該從這些信息中尋找什麼呢？

答：我們先來解釋一下不同柱子和批次之間重複性的不同方面。下面就說一下反相填料，因為他們更加普遍。

如果你用同一批填料的不同柱子，将會得到不同的塔闆數（峰寬），不同的柱壓，不同的保留時間。保留時間與填料密度和柱體積呈比例改變，而柱體積則取決于柱子的内徑。這個改變對你的方法應該是沒什麼影響的，因為所有峰的保留時間都呈比例的改變，而分離度還是沒變。這個原因導緻的保留時間變化的RSD通常在3%左右，但是如果生産商對柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子塔闆數的變化會影響方法，特别是做雙峰的時候，它們很少能達到基線分離的。盡管2-3%的塔闆數的标準偏差已經可以達到，但通常還是在±10%，記住塔闆數是個平方數，分離度僅僅取決于塔闆數的根。所以塔闆數2%的偏差相當于峰寬1%的偏差。你要确認一下柱子的廠家是有塔闆數的上下限，還是隻有一個下限，上下限都有比較讓人滿意。

同一裝填程序的柱子其柱壓的重複性是相當好的，同一批次變化應不超過±5%。 

 問：那麼批次之間的重複性怎麼樣呢？

答：如果你注意一下批次間的色譜參數，你會發現同參數會不同，更重要的是批次間分離的選擇性也會改變。就是說峰的相對保留會改變，比如他們在色譜圖中的相對位置，這對你方法的确定性是不利的。

這種改變是你要盡量避免的，所以你要從廠家那裡得到一些消息，他們是怎麼确保批次之間重複性的，這包括一些物理，化學，色譜方面的測試。在物理測試中，更重要的一項是裝填的表面積，該項參數的變化會直接導緻保留時間的變化。所以你要知道廠家認可的批次間表面積改變的幅度是多少。通常情況下幅度是±10%，但是±5%也是可以達到的。化學方面的參數更重要的是鍵合相的表面覆蓋率。通常用多少μmol/m² 表示。許多廠家并沒有直接給出這個參數，而隻說明了C的百分含量。我們希望看到的這個代替性的說明以及一個緊湊的幅度，通常是±10%，低于±4%的也可以達到。

更後你要知道廠家的色譜重複性測試，通常色譜柱會附帶一張色譜圖，檢測的是一些簡單的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是這不是一個好的批次間重複性測試。因為這些中性疏水化合物的相對保留重複性相當好，對裝填中表面覆蓋率的改變是相當不敏感的。好的批次間重複性測試還應在混合物中添加強堿化合物。在精心設計的測試中，精選的堿性化合物主要與殘餘矽羟基作用，而中性化合物則主要與鍵合相作用。隻有含有2種化合物的重複性測試才是讓人信服的。如果一個廠家是這樣測試的并且有好的重複性，那麼他的柱子會更加讓人放心。 

 問：我不知道廠家的測試與我的化合物的檢測有什麼聯系，我應該怎樣在我的檢測中确保一個好的批次間重複性呢？

答：你說的很對，上面的消息隻能讓你有一個比較大的機會确保重複性。但更後必須用你自己的檢測來做重複性測試。有些廠家提供一整套的設備包括不同裝填批次的柱子來做這個測試，另外有的廠家則按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的東西。同一裝填批次的色譜柱是沒有用的，你需要的是用不同鍵合反應裝填的柱子。如果同一批次是不同天内裝填，然後色譜柱編号又不同的時候的時候，你更好詢問2次，确保廠家給你的是你要的。

你需要3根不同批次的色譜柱來為你的方法做重複性測試。如果批次間的改變不影響你的檢測，那麼接下來的時間你的方法應該有一個好的重複性。